转录组概述
转录组是一系列RNA的集合（常见mRNA, lncRNA, circRNA, sRNA），推荐两篇综述阅读：A survey of best practices for RNA-seq data analysis、RNA sequencing: the teenage years.
转录组测序流程
RNA 样品检测
RNA 样品检测是建库的前置步骤，我们通过样品检测RNA样本总量与完整性，这两项指标是评判样本质量的关键点：
- Nanodrop检测RNA纯度(OD260/280)、浓度、核酸吸收峰。
- Aglient 2100检测RNA完整性（包含RIN值、28S/18S、图谱基线与5S峰）
奇奇怪怪的量都指的是啥
RIN值，即RNA Integrity Number，其反应样品的完整性如何，越接近10则样品完整性越高。
28S/18S，S即沉降系数，在真核生物的核糖体中主要含有28S、18S、5.8S与5S四种rRNA（原核生物为23S、16S和5S三种），计算28S/18S的比值（原核生物为23S/16S）可以衡量提取RNA完整性（即是否发生降解），1.8~2.0表明完整性较好，一般认为要大于等于1.5.
OD260/OD280、OD260/OD230代指吸收波长A230nm、A260nm与A280nm之间的比值，它们分别代表:
- A230nm为碳水化合物最高吸收峰波长
- A260nm为核酸最高吸收峰波长
- A280nm为蛋白质最高吸收峰波长
纯RNA样品标准为 1.7 < OD260/OD280 < 2.0（<1.7代表有蛋白或酚的污染，>2.0表明可能有异硫氰酸残留），OD260/OD230比值约为2.5（小于2.0表明存在糖类，盐类或有机溶剂的污染）。
2100峰图在集合了以上数据的基础上给出了样品检测峰图。
Aglient 2100
Agilent 2100 生物分析仪是一种“芯片上的实验室”技术，它会让片段跑过充满凝胶的微小通道（就像是电泳仪，或者说色谱仪一样），小的片段先到达，大的片段后到达，从而测出我们样品中各个大小片段的分布，一般情况下，我们的样本最好是集中在一些特定的bp长度下的。
如果发生了降解，那图谱基线就会上升（不同碱基长度的片段产生，抬升了图谱基线）。
建库
样品合格后，就需要进行建库（建立测序文库），主要流程如下：
- 用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA(此步骤对RNA的完整性要求比较高，一般RIN值要大于8，测序偏差)
- 加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断。（早期技术的限制使得测序读长有限，必须限制长度）
- 以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、NTPs、RNase H和DNA polymerase I 合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA;
- 纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPureXP beads进行片段大小选择;
- 最后通过PCR富集得到cDNA文库。（DNA更加稳定，适合测序）
文库样式如下
Y字接头自身不配对，用于和玻璃芯片(flow cell)上的接头连接，以进行桥式PCR。
Barcode用于唯一标识不同测序结果的样本来源（一次测序可能会混杂很多样本来源，以节省成本）。
文库中载荷包含待测序序列与测序引物结合位点。
文库质控
使用 Qubit2.0 初步定量，使用Agilent 2100对文库的insert size检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行定量（一般认为要大于2 nMol）。
Qubit2.0
Qubit2.0是一种荧光计，特殊的染料只会在与DNA结合的情况下发光，通过定量样品荧光强度就可以估算出我们的文库总浓度。
insert size
理想状态下扩增后的cDNA片段大小应该集中在一个区间内（注意我们已经将其打碎了），通过Agilent 2100就可以测出这些文库的长度分布。
Q-PCR
通过实时荧光定量PCR测出那些已经被正确组装好的文库数量（有效文库浓度），原理是设计特定的引物，使得其只能扩增被正确组装的文库（比如直接加入测序引物）。
与此同时我们还要介绍一个文库质量评估方法——mRNA片段化随机性检验，虽然其应当在建库时对mRNA进行随机打断的时候进行，但是也属于文库质控的一部分，故放在这部分介绍。
这个技术基于两个前提：已知测序目标mRNA的序列、随机断裂的真随机性，基于此背景，期望里mRNA随机断裂后形成的reads应当均匀覆盖原先的mRNA序列，那么断裂后的reads的测序结果比对在原mRNA上的分布应当是均匀的（5'-3'中间为平坦曲线）。
那么这里会有两种因素导致曲线向着3'端聚集：
- RNA降解（5'-3'）导致打断后靠近3'端的reads更多，测序结果中3'端的覆盖度更高。
- RNA降解后难以被磁珠整体捕获（磁珠一般拉住3'端），最终导致测序结果中3'端覆盖更高。
上机测序
二代测序：lllumina Novaseq平台测序（DNA簇、荧光偶联与桥式PCR）
测序原理——边合成边测序（SBS），基于单分子阵列的小型芯片（上有大量Y型配对接头）、桥式PCR反应、可逆性末段终结（dNTP上修饰有叠氮基团、切割位点与荧光基团） 。